东华大学史向阳教授《J. Control. Release》：可注射水凝胶用于肿瘤相关巨噬细胞的复极化及肿瘤的饥饿/化动联合治疗

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近日，东华大学史向阳教授团队与荷兰埃因霍芬理工大学Jan C. M. van Hest教授合作，利用一种简便的可注射原位凝胶化策略，将多种治疗试剂负载于凝胶网络中，实现了肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的复极化及肿瘤的饥饿/化动联合治疗。

在癌症治疗中，全身给药方式仍然存在递送效率偏低的特点，并且在杀死肿瘤细胞的同时会难以避免的对正常组织产生毒副作用，肿瘤局部给药策略有望将更多的治疗试剂局限在肿瘤部位，从而减轻全身给药引起的毒副作用。在该研究中，研究人员选用天然海藻酸钠（ALG）为原材料，利用ALG与生理环境中的Ca²⁺发生离子交换而成胶的原理，构建了一种负载葡萄糖氧化酶（GOx）、Fenton试剂Fe₃O₄NPs和Toll样受体激动剂R848三种多功能组分的可注射原位水凝胶体系（GPI/R848@ALG，如图1）。GOx作为一种氧化还原酶，可以催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢（H₂O₂），从而切断肿瘤生长和代谢所需要的能量供应，通过饥饿治疗促进肿瘤细胞凋亡。局部给药GOx可以有效降低静脉给药过程中出现的脱靶效应，提高GOx的适用性。Fe₃O₄ NPs一般具有稳定的立方反尖晶石结构，需要在较为苛刻的分解条件（例如较低的pH值）下才能释放出Fe²⁺和Fe³⁺用于化学动力学治疗（CDT）；而且，癌细胞内虽然具有过表达的H₂O₂，但其浓度仍然相对较低（50-200 μM），通过这种低效的Fenton反应难以生成足够的羟基自由基（·HO）来杀伤癌细胞。该研究利用GOx催化葡萄糖产生的葡萄糖酸和H₂O₂，不仅可以提高肿瘤微环境的酸度，加速Fe²⁺/Fe³⁺离子的释放，还可以提升H₂O₂的局部浓度，在进行肿瘤饥饿治疗的同时，进一步提高Fe₃O₄ NPs介导的CDT治疗效果。
此外据报道，肿瘤微环境中通常存在大量的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），由于致瘤信号分子的过度产生，TAMs主要表现为类似于M2型巨噬细胞的免疫抑制和促进肿瘤生长的功能，主导肿瘤的进展和转移，并会导致不良的预后。TAMs调节剂可以改变肿瘤微环境的功能方向，促进TAMs由促肿瘤的M2型转变为抑制肿瘤的M1表型，进而抑制肿瘤的进展。Fe3O4 NPs可以通过诱导与干扰素调节因子5（IRF5）途径相关的巨噬细胞发生表型转化，而Toll-样受体激动剂R848则主要通过激活核因子κB（NF-κB）信号通路使M2巨噬细胞极化为M1表型。
图1. 可注射多功能水凝胶用于肿瘤联合治疗的原理示意图（glucose oxidase (GOx)-conjugated polyacrylic acid-stabilized iron oxide nanoparticles，GPI NPs；polyacrylic acid-stabilized iron oxide nanoparticles，PI NPs）团队人员首先利用健康的ICR小鼠研究了水凝胶在生理环境中的体内成胶行为。如图2A-B所示，皮下注射Cy7-ALG或Cy5-GPI@ALG溶液到小鼠背部，通过小动物荧光成像系统（IVIS）监测到，ALG和GPI@ALG溶液能够在体内迅速转化为水凝胶，并在注射部位至少保留4天。值得注意的是，ALG浓度为5 mg/mL的GPI@ALG溶液成胶性能不太理想，发生了明显的扩散现象，这可能归因于其较高的流动特性，扩散到周围组织的药物会对健康组织造成毒副作用。
研究团队还在荷瘤裸鼠模型中考察了瘤内成胶和瘤内分布情况。将Cy5-GPI NPs和不同ALG浓度（5、10、20 mg/mL）的Cy5-GPI@ALG溶液注射到肿瘤内部，分别在注射后6 h和第6 d，手术切除肿瘤、切片，并进行荧光成像。从图2C看到，在注射6 h后，Cy5-GPI NPs和一定浓度的GPI@ALG（[ALG] = 5, 10 mg/mL）水凝胶可以均匀的分散在整个肿瘤组织中。而当ALG浓度为20 mg/mL时，形成的GPI@ALG水凝胶由于具有较高的模量和较差的流动性，无法扩散到整个肿瘤内部，如图3所示，GPI@ALG水凝胶的红色荧光主要集中在注射部位。因此，考虑到较好的成胶性能和均匀的瘤内分布情况，最终选择10 mg/mL的ALG浓度进行体外/体内治疗研究。
图2. 体内成胶性能和瘤内分布情况研究图3. 瘤内注射Cy5-GPI@ALG溶液6 h后的肿瘤荧光切片（[ALG] = 20 mg/mL）为了评价GPI NPs催化葡萄糖转化为葡萄糖酸和H₂O₂的催化活性，研究人员检测了经不同材料处理后葡萄糖溶液的pH值和H₂O₂含量变化。从图4A-B看到，GOx和GPI NPs均可以在2 h内将葡萄糖溶液（2 mg/mL）的pH值从7.4降低到4左右，产生H₂O₂的速率也十分接近，表明在合成GPI NPs的过程中GOx的酶活性没有受到显著影响。但是，GPI@ALG水凝胶则表现出了较缓慢的pH下降和延迟的H₂O₂生成速率，这可能是因为ALG水凝胶的网状结构阻碍了葡萄糖进入凝胶内部与GOx的接触。随后，他们用3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）作为指示剂，评估GPI NPs通过级联芬顿反应生成·OH的情况，无色的TMB可以被·OH氧化生成蓝色的oxTMB。从图4C中可以清楚地看到，加入葡萄糖（5 mM）后显著提高了650 nm处oxTMB的吸收值，这意味着GOx通过氧化葡萄糖、增加H₂O₂的浓度显著提高了·OH的生成。值得注意的是，酸性pH值条件（pH 5.0）和葡萄糖（5 mM）的存在进一步提高了·OH的产量。这说明，合成的GPI NPs能够在弱酸性的肿瘤微环境中有效地催化葡萄糖转化生成葡萄糖酸和H₂O₂，从而有助于提高Fe₃O₄介导的Fenton反应效率，生成更多的·OH杀伤肿瘤细胞。后续的CCK-8实验和Calcein-AM/PI染色结果（图4D-E）证实，GPI NPs的确比单独的GOx和PI NPs显示出更优越的肿瘤细胞杀伤效果。
图4. GOx、GPI和GPI@ALG水凝胶的催化活性评价（A-B）；体外·OH的产生（C）；细胞毒性及细胞吞噬性能研究（D-F）此外，体外TAMs复极化研究显示（图5A-E），PI@ALG、GPI@ALG和R848@ALG处理24 h后使CD11b+CD86+细胞（M1型巨噬细胞）的比例增加，CD11b+CD206+细胞（M2型巨噬细胞）的比例减少，表明Fe3O4和R848都可以有效地使TAMs从M2表型逆转为M1表型。更重要的是，经GPI/R848@ALG处理的巨噬细胞在所有组中表现出了最高的M1型比例（63.0%）和最低的M2型比例（14.4%），这意味着Fe3O4和R848协同增加了TAMs的逆转。ELISA结果（图5F-I）则表明，GPI/R848@ALG与TAMs孵育24 h后分别导致了TNF-α、IL-6和IL-12p40等促炎型细胞因子（由M1巨噬细胞分泌）的上调和抑炎型胞因子IL-10（由M2巨噬细胞分泌）的下调，进一步说明GPI/R848@ALG可以有效地将TAMs从M2表型复极化为M1型。这些结果证明，Fe3O4与R848联合使用可以获得更好的TAMs复极化效果，从而将肿瘤支持型微环境转变为肿瘤抑制型微环境，为进一步增强抗肿瘤治疗提供了的巨大可行性。
图5. TAMs复极化性能研究进一步的体内治疗研究结果如图6所示，结合了GOx与Fe₃O₄ NPs的GPI@ALG比单独的PI@ALG或GOx@ALG表现出了更明显的肿瘤抑制效果，这正是由于葡萄糖的消耗和增强的化学动力学治疗相互协同的结果。R848@ALG治疗组也比较明显地抑制了肿瘤的生长，这应该归因于R848将TAMs从促进肿瘤生长的M2表型重新极化为了抑制肿瘤生长的M1表型。此外，与其他各组相比，GPI/R848@ALG治疗组显示出了最小的肿瘤体积（图6B-C）、最高的小鼠生存率（图6D）以及最显著的肿瘤坏死和凋亡率（图6E），这说明通过（1）GOx催化的饥饿疗法、（2）Fe₃O₄介导的增强型化学动力学治疗以及（3）Fe₃O₄和R848诱导TAMs复极化的协同作用，显著提高了4T1肿瘤模型的抑制效果。图6. 体内联合治疗研究最后，研究人员评估了该可注射水凝胶组分的生物安全性。通过注射部位外周皮肤和重要组织器官的H&E染色结果发现，各组分的水凝胶未对表皮和真皮层产生明显的形态变化，也没有对正常组织器官产生明显的炎症浸润、形态改变和坏死等病理异常，显示出了良好的组织相容性。
总之，本研究提供了一种简便有效的治疗策略，利用ALG溶液与Ca²⁺之间的络合作用转化成为水凝胶，将治疗性试剂递送并局限在肿瘤区域内，降低对正常组织的毒副作用，通过肿瘤饥饿治疗、增强化学动力学治疗和辅助TAMs复极化作用协同增强了抗肿瘤效果。
本文第一作者为东华大学的博士生肖婷婷、硕士生贾亮和埃因霍芬理工大学的博士生朱建志，通讯作者为史向阳教授和Jan C. M. van Hest教授。
本论文工作得到了国家自然基金委中德中心项目（GZ1505）、国家自然科学基金国际合作项目（81761148028）和荷兰教育、文化与科学部引力计划（024.001.035）的支持。（本通讯稿不标注为原创，方便不同的微信公众号转载）。文章链接：https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2022.05.049

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